• Dr. Ludger Weß

Modifica geniale della pianta dell'edificio

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Editing del genoma. Dopo mezzo secolo di ricerca biologica molecolare, gli scienziati possono ora effettuare interventi precisi e mirati sul materiale genetico di piante, animali ed esseri umani. Che cosa significa questo per l'industria biotecnologica? E quali sono i vantaggi per gli investitori?

"La biotecnologia rivoluzionera' il nostro mondo." Tali titoli potrebbero essere letti dagli investitori negli anni '80. Alla fine degli anni '90. Intorno all'anno 2010. A intervalli regolari ci sono state ipotesi e promesse esagerate nella biotecnologia: Terapia genica, decodifica del genoma umano, terapia con cellule staminali. Presto, si diceva che in tutti i casi, numerose malattie sarebbero diventate curabili.

Oggi, speranze simili sono associate all'abbreviazione criptica CRISPR/Cas. Per sconfiggere la morte, per far misurare le persone sono le visioni associate alle "forbici genetiche". E gli investitori sentono l'odore della prossima grande cosa.

Nella maggior parte dei casi, le cose non sono andate così velocemente come speravamo. Tuttavia, nel corso dei decenni, la biotecnologia ha raggiunto risultati medici ed economici rivoluzionari. I batteri geneticamente modificati producono farmaci come anticorpi, insulina o altri ormoni come organismi di produzione da quattro decenni. I processi biotecnologici hanno rivoluzionato lo sviluppo di vaccini, vitamine, aminoacidi, coloranti o integratori alimentari. Le piante geneticamente modificate possono difendersi dai parassiti senza danneggiare gli organismi benefici - la loro coltivazione ha reso superfluo l'uso di diversi milioni di tonnellate di insetticidi.

Anche la terapia genica sta facendo progressi. Le prime malattie come l'immunodeficienza combinata grave (SCID), l'anemia falciforme e probabilmente anche l'emofilia possono essere curate con questi metodi. Infine, la biologia molecolare ha permesso di compiere grandi progressi nella comprensione, nella diagnosi e nel trattamento di innumerevoli malattie.

Gli investitori con una prospettiva a lungo termine hanno potuto trarne enormi vantaggi. Coloro che hanno investito solo 4000 dollari in azioni Amgen nel 1998 sono ora seduti su un conto di deposito da un milione di dollari.

Anche altri produttori di farmaci come Biogen Idec, Celgene, Medivation e Questcore hanno moltiplicato il capitale dei loro investitori. Altrettanto positive sono state le imprese che si occupano di "infrastrutture" della biotecnologia. Le azioni di Illumina, che produce apparecchiature di sequenziamento genetico, sono aumentate di oltre il 3900% negli ultimi dieci anni.

L'altro lato della medaglia: le fluttuazioni dei prezzi in questo settore sono enormi. Il corso dell'azione Amgen è sceso da un massimo di 84 euro nel settembre 2001 a 26 euro nel marzo 2008, prima del decollo.

Solo tre tecnologie sono state e sono fondamentali per il successo delle aziende modello: La prima consente ai biotecnologi di determinare la sequenza dei mattoni del DNA del materiale genetico e quindi di leggere le informazioni genetiche. Il secondo permette di replicare il DNA (clonato) e il terzo permette di trasferire le informazioni genetiche di un organismo alle cellule di un altro in modo tale da poterle utilizzare.

I primi due metodi sono ormai ampiamente utilizzati ed esauriti dal punto di vista economico. Possono solo essere accelerate e/o miniaturizzate e portare al "laboratorio sul chip". Le informazioni genetiche degli agenti patogeni, ad esempio, possono quindi essere lette direttamente al capezzale per trovare la terapia più efficace.

Il terzo, invece, era difficilmente applicabile dal punto di vista medico fino a pochi anni fa. Per molto tempo, il nuovo materiale genetico ha potuto essere integrato nell'organismo ricevente solo per caso dopo la trasmissione. Questo metodo del fucile da caccia era costoso e rischioso. Come si poteva garantire che il gene fosse integrato in un punto in cui non solo funzionasse in modo affidabile, ma non causasse effetti indesiderati o addirittura danni? Spesso è stato necessario trasferire geni ausiliari, il che ha ulteriormente complicato la tecnologia.

Qualche anno fa, due donne, la microbiologa francese Emmanuelle Charpentier e la biochimica americana Jennifer Doudna, hanno fatto una scoperta rivoluzionaria. I batteri utilizzano un meccanismo specifico per tagliare specificamente il materiale genetico dei virus in siti precisamente predeterminati (e solo lì).

Charpentier e Doudna hanno riconosciuto nel 2012 che il cosiddetto sistema CRISPR/Cas è adatto alla ricerca e alla medicina come forbici genetiche universalmente applicabili (spiegazione dettagliata, pagina 82). Per la prima volta è possibile tagliare il materiale genetico in un punto ben definito e apportare modifiche mirate a questa interfaccia. Questa può essere la disattivazione di un gene. Uno o più nuovi geni possono anche essere inseriti nell'interfaccia. Il metodo è simile alla funzione di ricerca/sostituzione di un word processor e può ora essere applicato a più geni contemporaneamente.

Il terzo pioniere della CRISPR è Feng Zhang, che è riuscito ad estendere il metodo per includere l'RNA prodotto in cellule umane, animali e vegetali al fine di trasportare l'informazione genetica dalla memoria del nucleo cellulare in modo che possa essere utilizzata dalla macchina cellulare. In questo modo è possibile modificare temporaneamente il programma genetico di una cellula.

Utilizzando questa tecnologia, i ricercatori hanno già curato topi di atrofia muscolare ereditaria e SLA, reso le cellule umane immuni al virus dell'AIDS, immunizzato innumerevoli piante contro i parassiti e le scimmie e gli embrioni umani geneticamente modificati. In Cina, i primi studi sui pazienti oncologici sono già iniziati. Non c'è da stupirsi se i tre sono diventati delle superstar della scienza, sono stati inondati di premi e sono considerati candidati al Premio Nobel.

Nel novembre 2014, la star di Hollywood Cameron Diaz e il boss di Twitter Dick Costolo hanno consegnato a Charpentier e Doudna il "Breakthrough Prize in Life Sciences", con un premio in denaro di 2,4 milioni di euro. Per la rivista "MIT Technology Review", CRISPR/Cas è già la più importante scoperta biotecnologica del secolo. Gli ottimisti stimano il potenziale di vendita della tecnologia a 4-10 miliardi di dollari nel 2025.

Queste prospettive accendono anche l'immaginazione degli investitori. Ma la domanda è: sono realistici? E quali aziende ne beneficeranno effettivamente? Naturalmente, tutti e tre i ricercatori sono coinvolti con i loro brevetti nei leader di mercato in questo campo. Charpentier ha co-fondato CRISPR Therapeutics, Doudna le società Caribou Biosciences e Intellia Therapeutics. Insieme a Zhang, si occupa anche di Editas Medicina.

Caribou è stata fondata da Doudna nel 2011 a Berkeley, USA. L'azienda ha raccolto oltre 40 milioni di dollari in capitale di rischio e si considera uno sviluppatore tecnologico. Si occupa di medicina veterinaria, applicazioni industriali e agricole e collabora con Novartis, tra gli altri.

Intellia Therapeutics è stata fondata a Cambridge, USA, nel 2014 come spin-off per il trattamento delle malattie genetiche nell'uomo. Mentre Caribou è ancora finanziato esclusivamente da venture capital e ricavi, Intellia ha raccolto 85 milioni di dollari da venture capitalist e poi è diventata pubblica nel maggio 2016. Insieme a Novartis, l'azienda prevede di utilizzare la tecnologia CRISPR per aggiornare le cellule immunitarie dei pazienti oncologici al di fuori del corpo contro i tumori e poi restituirle ai pazienti.

Editas, anch'essa fondata a Cambridge, Massachusetts, nel 2013, ha ricevuto 163 milioni di dollari da venture capitalist prima di essere quotata per la prima volta al Nasdaq nel febbraio 2016. Oltre a Doudna, Zhang detiene anche una partecipazione in questa società. Editas collabora con Adverum Biotecnologie, Allergan e Juno Therapeutics.

Infine, CRISPR Therapeutics è stata co-fondata da Charpentier a Basilea nell'aprile 2014 e ha raccolto 127 milioni di dollari in capitale di rischio prima di essere quotata alla Borsa svizzera nell'aprile 2017; tra i principali azionisti figurano Bayer, GlaxoSmithKline, Vertex e Celgene. L'azienda sviluppa terapie per le malattie genetiche.

Dopo l'IPO, i titoli hanno generalmente portato i loro investitori a guadagni di prezzo. Tuttavia, le fluttuazioni sono state enormi (riquadro in basso a sinistra). Quanta fantasia c'è oggi in questi titoli, ein Blick mostra il valore di mercato. In Borsa oggi, le tre ammiraglie sono valutate insieme a vier Milliarden dollars - nonostante nessuna delle tre società stia generando ricavi ad eccezione dei fondi versati dai partner farmaceutici per la concessione di licenze, la ricerca e il raggiungimento di obiettivi contrattuali ("milestone payments").

Mario Linimeier, uno degli amministratori delegati della boutique del fondo Medical Strategy, che osserva il settore da molto tempo, ritiene tuttavia che le azioni siano di interesse a lungo termine: "La tecnologia di editing del genoma ha un potenziale distruttivo."La tecnologia Der sta affrontando un grande futuro". L'interesse delle grandi case farmaceutiche avrà anche un effetto positivo sull'andamento delle quotazioni azionarie.

Il problema fondamentale rimane il fatto che nessuna delle aziende ha finora condotto uno studio clinico. Gli scienziati concordano sul fatto che CRISPR/Cas è uno strumento fantastico per la ricerca: molto veloce, modulare e poco costoso. Gli "ingredienti" necessari per un esperimento CRISPR/Cas possono essere ottenuti per meno di 100 dollari. Non sono d'accordo sulla questione dell'effettiva idoneità della tecnologia a fini terapeutici. Molti esperti sono ancora preoccupati per l'accuratezza del metodo. Inoltre, per alcuni non sembra abbastanza scalabile per le applicazioni industriali perché il numero di cellule modificate con successo per esperimento è troppo piccolo.

Un secondo punto essenziale è la questione irrisolta dei brevetti. Tali controversie sono diffuse nell'industria biotecnologica e raramente portano a vincitori evidenti. La disputa sui cosiddetti DNA chip è famosa. Grazie ad un brevetto insolitamente ampio, l'azienda statunitense Affymetrix è riuscita ripetutamente a bloccare i concorrenti e quindi, alla fine, a progredire.

L'annosa disputa brevettuale su altre due importanti invenzioni biotecnologiche - anticorpi umanizzati e interferenze dell'RNA - si è conclusa con un accordo transattivo. È quindi impossibile prevedere chi dei "quattro grandi" sarà in grado di utilizzare quali parti della tecnologia per quali scopi commerciali.

Il culto stellare intorno agli inventori del metodo CRISPR/Cas ha fatto sì che le aziende che utilizzano altri metodi più complessi di editing del genoma siano meno al centro dell'attenzione. Lavorano con metodi non controversi ai sensi del diritto brevettuale, come la nucleasi delle dita di zinco o TALEN. TALEN, la "nucleasi effettore-attivatore di trascrizione", è un enzima che riconosce e taglia anche sequenze specifiche nel DNA. Le nucleasi delle dita di zinco sono enzimi prodotti artificialmente che possono attraccare in certi punti del genoma e tagliare il DNA. Il suo nome deriva da una struttura a forma di dito in cui è incorporato un atomo di zinco. Possono essere costruiti per riconoscere una specifica sequenza di DNA. Possono anche essere utilizzati per tagliare un genoma complesso in un punto specifico e inserire nuovo materiale genetico in modo mirato. Tuttavia, la loro produzione è più complessa e più costosa del sistema CRISPR/Cas. Lo svantaggio più grave è che la produzione di enzimi è complessa e quindi dispendiosa in termini di tempo e denaro.

Tuttavia, Sangamo Therapeutics, che si concentra sulle nucleasi delle dita di zinco, è stata la preferita da molti investitori negli ultimi 18 mesi. Da allora il prezzo delle azioni è più che quadruplicato. "Il catalizzatore è stata una partnership con Pfizer per sviluppare congiuntamente trattamenti per l'emofilia ereditaria e la SLA, una partnership con Gilead Sciences per sviluppare approcci per la terapia del cancro e i primi dati positivi di uno studio clinico in pazienti con sindrome di Hunter", spiega Linimeier.

È anche vero per TALEN che la produzione dell'enzima è complessa e costosa. Tuttavia, molti ricercatori ritengono che, per la sua precisione, sia più adatto all'uso terapeutico. Al momento, tuttavia, non esiste un'azienda che utilizza TALEN come unico strumento terapeutico. Cellectis, che è elencato sul Nasdaq, utilizza il metodo perché il numero di cellule modificate con successo è molto più alto che con qualsiasi altra tecnologia. Ad esempio, l'azienda utilizza una linea cellulare modificata da TALEN per combattere una specifica forma di leucemia. I primi studi clinici condotti in collaborazione con Pfizer e Servier hanno dimostrato la sicurezza dell'applicazione.

Bluebird Bio, anch'essa quotata in borsa, utilizza una modifica della tecnologia TALEN come metodo per il trattamento delle malattie ereditarie e del cancro; tuttavia, non esiste ancora uno studio clinico con TALEN.

Nonostante gli ovvi vantaggi, CRISPR/Cas ha ampiamente sostituito TALEN. La società Addgene, che vende ai ricercatori kit - confezioni complete contenenti gli ingredienti di entrambe le tecnologie - riferisce di aver venduto un numero record di 2800 kit TALEN nel 2013, ma che la domanda è costantemente diminuita da allora. Lo stesso vale per i kit per le dita di zinco. In confronto, Addgene ha venduto più di 20000 kit CRISPR nel 2015.

Quale metodo prevarrà alla fine è quindi ancora aperto. Ma una cosa è già oggi chiara: la tecnologia dell'editing del genoma rivoluzionerà il nostro mondo.

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Controllo dei concetti - che cos'è esattamente CRISPR/Cas?

I batteri sono regolarmente infettati da virus. Si difendono tagliando alcune sezioni del materiale genetico dei virus e rendendoli così inefficaci. Se i batteri sono sopravvissuti con successo ad un'infezione virale, i segmenti genici del virus sono conservati in una sorta di contenitore direttamente nel materiale genetico dei batteri.

Questo armadio di alimentazione è costituito da gruppi (cluster) di brevi sezioni di DNA che possono essere letti sia in avanti che all'indietro (i cosiddetti palindromi) e vengono ripetuti più volte ("ripetizioni"). I pezzi del genoma virale sono disposti in spazi regolari (sono regolarmente intervallati). L'abbreviazione criptica CRISPR sta quindi per cluster di ripetizioni palindromiche brevi e regolarmente interspaziate.

Questa parte del meccanismo serve, per così dire, come memoria immunitaria del batterio. La regione CRISPR con le impronte digitali dei virus può essere letta se necessario e riscritta in RNA - una sorta di copia di lavoro delle informazioni genetiche. Questo RNA forma una struttura ad anello molto caratteristica alla quale è collegato il profilo del virus.

E' qui che entra in gioco l'elemento entusiasmante per la ricerca e la medicina. Il cosiddetto enzima Cas, un altro elemento del sistema immunitario batterico, riconosce questa struttura ad anello e vi si aggancia. La parte terminale libera dell'RNA - il profilo del virus - insieme al Cas allegato, è attaccata ai geni del virus che sono penetrati dai batteri durante una nuova infezione.

Il pezzo finale dell'RNA con le informazioni sul virus dell'enzima Cas serve quindi come cane da fiuto, per così dire, che guida l'enzima nel posto giusto. Lì, l'enzima Cas taglia il sito che viene pre-disegnato dalla RNA. La consueta designazione di CRISPR/Cas come "forbici geniche" è quindi molto appropriata.

Ricercatori e medici possono utilizzare l'enzima Cas per apportare modifiche mirate al materiale genetico di piante, animali ed esseri umani. Collegando un RNA corrispondente ad un loop CRISPR, la proteina Cas può essere indirizzata in qualsiasi punto del genoma per tagliare il DNA.

In natura, frammenti casuali di DNA vengono inseriti nel sito di taglio. La regione in questione, che ha origine da un virus, non è più funzionale. Con CRISPR/Cas, i singoli geni possono essere specificamente disattivati nello stesso modo. Il cambiamento è quindi indistinguibile da una mutazione naturale. Ma è anche possibile aggiungere qualcosa di nuovo con CRIPR/Cas: Se durante il trattamento vengono aggiunti frammenti di DNA le cui estremità si adattano all'interfaccia, essi si inseriscono con estrema precisione nella posizione precisamente identificabile. In questo modo, i segmenti genici possono essere specificamente scambiati o inseriti in posizioni definite nel genoma.

Il metodo CRISPR/Cas è solo una delle possibilità del cosiddetto "genoma editing", che include anche metodi come TALEN, zinco finger nuclease e altri. La loro caratteristica comune: a differenza dell'ingegneria genetica classica, il luogo in cui avviene il cambiamento può essere controllato con precisione. CRISPR/Cas è il più elegante, economico e semplice di tutti questi metodi. Viene quindi utilizzato anche da università e istituti di ricerca di paesi in cui non sono disponibili ingenti risorse finanziarie per la ricerca.

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Autore: Dr. Ludger Weß

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